DR5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401002-ACT

TNFRSF10B codifica il recettore di morte 5 (DR5), un membro della superfamiglia dei recettori del TNF presente sulla superficie cellulare, che lega TRAIL per avviare l’apoptosi estrinseca. In seguito al legame con il ligando, DR5 favorisce l’assemblaggio del complesso di segnalazione induttore di morte (DISC), portando all’attivazione della caspasi-8 e delle cascate di caspasi effettrici a valle, con crosstalk con l’apoptosi mitocondriale tramite il clivaggio di BID. La segnalazione di DR5 interseca le vie di NF-κB e MAPK ed è modulata dal traffico del recettore, dai recettori decoy e da regolatori anti-apoptotici come cFLIP e le proteine IAP. La disregolazione dell’espressione o della segnalazione di TNFRSF10B è spesso oggetto di studio in contesti quali la sopravvivenza delle cellule tumorali, la citotossicità mediata dal sistema immunitario e i meccanismi di resistenza all’apoptosi.

DR5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNFRSF10B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DR5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNFRSF10B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNFRSF10B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DR5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNFRSF10B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DR5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DR5 nelle cellule tumorali con espressione di TNFRSF10B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.