DR5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401002-ACT

TNFRSF10B kodiert den Todesrezeptor 5 (DR5), ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie an der Zelloberfläche, das an TRAIL bindet und dadurch die extrinsische Apoptose einleitet. Nach Ligandenbindung fördert DR5 die Zusammenlagerung des „death-inducing signaling complex“ (DISC), was zur Aktivierung von Caspase‑8 und nachgeschalteten Effektor‑Caspase-Kaskaden führt, mit Crosstalk zur mitochondrialen Apoptose über die Spaltung von BID. Die DR5-Signalübertragung greift in NF‑κB- und MAPK-Signalwege ein und wird durch Rezeptor-Trafficking, Decoy-Rezeptoren sowie antiapoptotische Regulatoren wie cFLIP und IAP-Proteine moduliert. Eine Fehlregulation der TNFRSF10B-Expression oder -Signalübertragung wird häufig im Zusammenhang mit dem Überleben von Tumorzellen, immunvermittelter Zytotoxizität und Mechanismen der Apoptoseresistenz untersucht.

DR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF10B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF10B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF10B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DR5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF10B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DR5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DR5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF10B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.