Dnmt3L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403892-ACT

Il gene umano **DNMT3L** codifica **Dnmt3L**, un cofattore simile a una DNA metiltransferasi cataliticamente inattivo che si lega alle metiltransferasi *de novo* **DNMT3A** e **DNMT3B** e ne stimola l’attività per stabilire i pattern di metilazione del DNA durante lo sviluppo. Riconoscendo le code dell’istone H3 non metilate e promuovendo l’attività di metilazione associata alla cromatina, Dnmt3L contribuisce al silenziamento epigenetico, all’imprinting genomico e alla repressione dei trasposoni. La regolazione mediata da DNMT3L interagisce con il rimodellamento della cromatina e con vie di controllo trascrizionale che influenzano le decisioni sul destino cellulare. La deregolazione del macchinario di metilazione *de novo* e gli stati epigenetici alterati dipendenti da DNMT3L sono spesso studiati nel contesto del silenziamento genico aberrante e dell’instabilità genomica rilevanti per il cancro e per l’epigenetica dello sviluppo.

Dnmt3L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNMT3L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dnmt3L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNMT3L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNMT3L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dnmt3L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNMT3L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dnmt3L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dnmt3L nelle cellule tumorali con espressione di DNMT3L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.