DNAM-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402189-ACT

CD226 codifica DNAM-1, un recettore di adesione e co-stimolazione della superfamiglia delle immunoglobuline, espresso sulle cellule NK, sui linfociti T CD8+ e su sottopopolazioni di linfociti T CD4+ e di monociti. DNAM-1 si lega ai ligandi CD155 (PVR) e CD112 (NECTIN2) per favorire la formazione della sinapsi immunologica, la polarizzazione dei granuli citotossici e il rilascio di citochine, integrandosi con reti di segnalazione che modulano l’attivazione dei linfociti e il riconoscimento delle cellule bersaglio. Grazie al suo ruolo nel bilanciamento tra segnali attivatori e inibitori, CD226 influenza la sorveglianza immunitaria antitumorale e le risposte alle infezioni virali. Le varianti genetiche e l’espressione deregolata di CD226 sono state associate alla suscettibilità a patologie immuno-mediate, supportandone l’impiego come nodo di ricerca per lo studio delle vie infiammatorie e dell’eterogeneità funzionale delle cellule immunitarie.

DNAM-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD226 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNAM-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD226 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD226, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNAM-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD226 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNAM-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNAM-1 nelle cellule tumorali con espressione di CD226 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.