DnaJC3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405100-ACT

DNAJC3 codifica DnaJC3, un co-chaperone Hsp40 associato al reticolo endoplasmatico che modula la proteostasi interagendo con BiP/GRP78 e attenuando la segnalazione mediata da PERK durante la risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR). Collegando l’attività dei chaperoni al rilevamento dello stress del RE, DnaJC3 contribuisce a regolare il controllo della traduzione, la capacità di ripiegamento proteico e il recupero dallo stress proteotossico, con effetti a valle su apoptosi e segnalazione infiammatoria. La disregolazione delle vie di stress del RE che coinvolgono DnaJC3 è stata collegata a una maggiore vulnerabilità cellulare in contesti metabolici e neurodegenerativi, in cui l’attivazione cronica dell’UPR può compromettere la funzione secretoria e l’omeostasi mitocondriale. In quanto nodo del controllo di qualità del RE, DnaJC3 è rilevante per studi meccanicistici sull’adattamento allo stress, sul rimodellamento del proteoma e sulle decisioni di destino cellulare in condizioni di stress nutrizionale o ossidativo.

DnaJC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNAJC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DnaJC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNAJC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNAJC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DnaJC3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNAJC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DnaJC3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DnaJC3 nelle cellule tumorali con espressione di DNAJC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.