DNA pol β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402861-ACT

POLB codifica la DNA polimerasi beta (DNA pol β), un enzima chiave della via di riparazione per escissione di basi (BER) che riempie gap a singolo nucleotide e partecipa alla riparazione short-patch dopo la rimozione di basi danneggiate. La DNA pol β agisce nei siti di danno ossidativo e da alchilazione, coordinandosi con XRCC1, DNA ligasi III e APE1 per mantenere la stabilità del genoma durante la replicazione e nelle cellule non proliferanti. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di POLB sono state associate a un aumento del carico mutazionale, instabilità cromosomica e risposte aberranti al danno al DNA osservate in molteplici tipi di tumore e in modelli di malattie neurodegenerative. In quanto fattore centrale della BER, POLB viene spesso studiato nel contesto della segnalazione dello stress genotossico, della riparazione associata alla replicazione e dei meccanismi di resistenza ad agenti che danneggiano il DNA in sistemi cellulari.

DNA pol β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol β nelle cellule tumorali con espressione di POLB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.