DNA pol α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402762-ACT

POLA1 codifica a subunidade catalítica da DNA polimerase alfa humana (DNA pol α), uma polimerase associada à primase e essencial para iniciar a replicação do DNA cromossômico ao estender os primers RNA–DNA sintetizados nas origens de replicação e na fita retardatária. Essa atividade coloca a POLA1 no núcleo do programa de iniciação da replicação, coordenando-se com o licenciamento das origens e a montagem do replissomo para sustentar a progressão da fase S e a estabilidade do genoma. A perturbação da função da DNA pol α pode promover estresse replicativo, dinâmica alterada das forquilhas de replicação e respostas subsequentes a danos no DNA que se cruzam com a sinalização de checkpoints e vias de manutenção da cromatina. A POLA1 tem sido implicada em distúrbios ligados a defeitos no metabolismo de ácidos nucleicos e na sinalização imune, e é frequentemente estudada no contexto do controle proliferativo e da instabilidade genômica associada à replicação.

DNA pol α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol α em células tumorais com expressão de POLA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.