DLST Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409604-ACT

DLST (dihydrolipoamide S-succinyltransferase) codifica la componente centrale E2 del complesso mitocondriale della 2-ossoglutarato deidrogenasi, un nodo enzimatico chiave nel ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA). Catalizzando la formazione di succinil-CoA a partire da α-chetoglutarato e coordinando il trasferimento di gruppi acilici dipendente dal lipoato, DLST sostiene il metabolismo ossidativo, la produzione di NADH e l’equilibrio redox mitocondriale. La funzione di DLST collega il metabolismo centrale del carbonio al catabolismo degli amminoacidi e a una più ampia omeostasi mitocondriale, processi spesso studiati in contesti di stress metabolico e disfunzione mitocondriale. In letteratura, un’alterata regolazione dei componenti del ciclo TCA, incluso DLST, è stata associata al rimodellamento bioenergetico osservato nella biologia delle malattie neurodegenerative e proliferative, a sostegno della sua rilevanza per la ricerca meccanicistica.

DLST Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DLST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DLST Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DLST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DLST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DLST. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DLST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DLST nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DLST nelle cellule tumorali con espressione di DLST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.