DIO3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403729-ACT

DIO3 codifica la deiodinasi di tipo III degli iodotironini (DIO3), una selenoenzima integrale di membrana che inattiva gli ormoni tiroidei convertendo la T4 in T3 inversa (rT3) e la T3 in T2, limitando così la segnalazione locale degli ormoni tiroidei. Modellando la disponibilità ormonale in modo specifico per ciascun tessuto, DIO3 influenza i programmi trascrizionali governati dai recettori degli ormoni tiroidei e contribuisce alla tempistica dello sviluppo, all’omeostasi metabolica e alla differenziazione cellulare. L’espressione di DIO3 è regolata in contesti quali l’imprinting genomico e la segnalazione associata all’ipossia, e la sua disregolazione è stata collegata ad alterazioni dei set point endocrini e del controllo della crescita. Nel cancro e nei disturbi dello sviluppo, l’attività aberrante di DIO3 è spesso studiata come meccanismo capace di modificare le reti di espressione genica dipendenti dagli ormoni tiroidei nel microambiente tumorale o durante l’organogenesi.

DIO3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DIO3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DIO3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DIO3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DIO3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DIO3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DIO3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DIO3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DIO3 nelle cellule tumorali con espressione di DIO3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.