DIO3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403729-ACT

DIO3 kodiert die Typ-III-Iodthyronin-Deiodinase (DIO3), ein integrales Membran-Selenoenzym, das Schilddrüsenhormone inaktiviert, indem es T4 zu reverses T3 und T3 zu T2 umwandelt und dadurch die lokale Schilddrüsenhormon-Signalübertragung begrenzt. Durch die Steuerung der gewebespezifischen Hormonverfügbarkeit beeinflusst DIO3 die von Schilddrüsenhormonrezeptoren gesteuerten Transkriptionsprogramme und trägt zum Entwicklungs-Timing, zur metabolischen Homöostase und zur zellulären Differenzierung bei. Die DIO3-Expression wird in Kontexten wie genomischem Imprinting und hypoxieassoziierter Signalgebung reguliert, und eine Fehlregulation wurde mit veränderten endokrinen Sollwerten und Wachstumssteuerung in Verbindung gebracht. Bei Krebs und Entwicklungsstörungen wird eine aberrante DIO3-Aktivität häufig als Mechanismus untersucht, der schilddrüsenhormonabhängige Genexpressionsnetzwerke im Tumormikromilieu oder während der Organogenese modifiziert.

DIO3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DIO3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DIO3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DIO3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DIO3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DIO3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DIO3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DIO3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DIO3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DIO3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.