Plásmido CRISPR de Activación (h) Dia 1: sc-401929-ACT

DIAPH1 (Dia 1) codifica una formina relacionada con Diaphanous que regula la nucleación y elongación de los filamentos de actina aguas abajo de la señalización de las GTPasas Rho. Dia 1 coordina la remodelación del citoesqueleto necesaria para la polaridad celular, la adhesión, la citocinesis y la migración dirigida, y también contribuye a la estabilización de los microtúbulos mediante el crosstalk actina–microtúbulo. A través de estos procesos, DIAPH1 influye en vías que gobiernan la mecanotransducción y la dinámica de membrana, incluida la formación de filopodios y el ensamblaje del anillo contráctil. La actividad desregulada de DIAPH1 se ha asociado con fenotipos alterados de motilidad y división celular, y en la literatura se vincula con fenotipos del desarrollo y hematológicos/vasculares, lo que respalda su relevancia para estudios de mecanismos de enfermedad.

Dia 1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DIAPH1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Dia 1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DIAPH1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DIAPH1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Dia 1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DIAPH1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Dia 1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Dia 1 en células tumorales con expresión de DIAPH1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.