dHAND Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402017-ACT

HAND2 (dHAND) codifica um fator de transcrição do tipo hélice–alça–hélice básico (bHLH) que controla a especificação de linhagens mesenquimais e a morfogênese de órgãos, com papéis de destaque no desenvolvimento cardíaco, em derivados da crista neural e no padrão de formação dos membros. O dHAND integra redes de sinalização do desenvolvimento, incluindo BMP, WNT/β-catenina, NOTCH e SHH, para regular programas gênicos que governam proliferação, migração e diferenciação. Na biologia humana, alterações na expressão de HAND2 ou disfunções regulatórias estão associadas a defeitos cardíacos congênitos e a anomalias do desenvolvimento mais amplas, e o controle transcricional desregulado tem sido investigado em contextos de remodelamento cardíaco e biologia tumoral. Essas propriedades tornam HAND2 um nó útil para dissecar circuitos transcricionais e decisões de destino celular em modelos relevantes de células e organoides.

dHAND O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HAND2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

dHAND O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HAND2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HAND2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de dHAND. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HAND2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de dHAND no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via dHAND em células tumorais com expressão de HAND2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.