Dermatopontin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402924-ACT

Il gene DPT umano codifica la dermatopontina, una proteina della matrice extracellulare (ECM) che si lega ai collagene e “decora” le reti fibrillari, influenzando l’organizzazione della matrice, l’adesione cellula–matrice e le proprietà biomeccaniche dei tessuti connettivi. La dermatopontina contribuisce al comportamento dei fibroblasti e al rimodellamento dell’ECM modulando le interazioni tra fibrille di collagene, proteoglicani e recettori di superficie cellulare, sostenendo processi come la riparazione delle ferite e l’architettura dello stroma. Le alterazioni dell’espressione di DPT e della composizione dell’ECM sono spesso analizzate in contesti di fibrosi, stroma associato ai tumori e rimodellamento vascolare o dermico, in cui i cambiamenti nell’organizzazione del collagene e nell’adesione cellulare influenzano la funzione tissutale. In quanto regolatore associato alla matrice, DPT è rilevante anche per studi sul rimodellamento guidato da TGF-β e su programmi trascrizionali più ampi legati alla meccano-trasduzione.

Dermatopontin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DPT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dermatopontin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DPT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DPT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dermatopontin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DPT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dermatopontin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dermatopontin nelle cellule tumorali con espressione di DPT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.