DEPTOR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402253-ACT

DEPTOR (DEP domain containing MTOR interacting protein) è un inibitore endogeno della segnalazione di mTOR che si lega e modula sia il complesso mTORC1 sia mTORC2. Regolando gli output di fosforilazione che controllano la sintesi proteica, l’autofagia, il metabolismo e la dinamica del citoscheletro, DEPTOR contribuisce a coordinare i programmi di crescita e sopravvivenza a valle dei segnali di nutrienti e fattori di crescita. Un’alterata espressione di DEPTOR è stata collegata alla deregolazione dell’attività della rete PI3K–AKT–mTOR osservata in molteplici contesti associati a malattia, inclusi la biologia dei tumori e le risposte allo stress metabolico. In quanto nodo che accoppia l’attività dei complessi mTOR alla regolazione tramite feedback, DEPTOR è spesso studiato per i suoi effetti sulla proliferazione cellulare, sulla sensibilità all’apoptosi e sulla rimodulazione adattativa della segnalazione.

DEPTOR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DEPTOR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DEPTOR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DEPTOR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DEPTOR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DEPTOR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DEPTOR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DEPTOR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DEPTOR nelle cellule tumorali con espressione di DEPTOR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.