Deltex-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404446-ACT

Il gene umano DTX1 codifica Deltex-1, una ligasi E3 dell’ubiquitina che agisce come modulatore chiave della segnalazione del recettore Notch e dei programmi trascrizionali a valle che governano decisioni di destino cellulare, differenziamento e regolazione immunitaria. Attraverso il controllo ubiquitina-dipendente dei componenti della via di Notch, Deltex-1 influenza la durata e l’intensità del segnale, intersecandosi con la proteostasi e con reti di regolazione trascrizionale. Un’attività alterata di DTX1/Deltex-1 è stata associata a contesti di segnalazione Notch deregolata rilevanti per la biologia delle cellule ematopoietiche e immunitarie, ed è frequentemente studiata in modelli di rimodellamento oncogenico delle vie di segnalazione e di segnalazione infiammatoria. Queste proprietà rendono DTX1 un bersaglio utile per studi meccanicistici che collegano l’ubiquitinazione a fenotipi dipendenti dalle vie di segnalazione.

Deltex-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DTX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Deltex-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DTX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DTX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Deltex-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DTX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Deltex-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Deltex-1 nelle cellule tumorali con espressione di DTX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.