DDB1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419966-ACT

DDB1 murina (damage specific DNA binding protein 1) è un adattatore centrale del complesso ligasi E3 dell’ubiquitina CUL4–DDB1, che coordina la degradazione ubiquitina-dipendente di proteine regolatorie coinvolte nel mantenimento del genoma. Partecipa alla riparazione per escissione di nucleotidi, al licensing della replicazione del DNA, al rimodellamento della cromatina e alla progressione del ciclo cellulare, assemblando recettori di substrato e modulando la proteostasi in seguito a stress genotossico. Attraverso queste vie, DDB1 influenza le risposte allo stress replicativo e i programmi trascrizionali legati alla proliferazione e alla differenziazione cellulare. La disregolazione della segnalazione dell’ubiquitina associata a DDB1 e dei circuiti di riparazione del DNA è spesso studiata in modelli di instabilità genomica e in ambiti biologici rilevanti per il cancro.

DDB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ddb1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ddb1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ddb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ddb1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDB1 nelle cellule tumorali con espressione di Ddb1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.