DC-SIGN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401368-ACT

CD209 codifica DC-SIGN (CD209), un recettore lectinico di tipo C espresso prevalentemente sulle cellule dendritiche e su specifiche sottopopolazioni di macrofagi, dove media il riconoscimento calcio-dipendente di glicani ad alto contenuto di mannosio e fucosilati. Attraverso il legame ai ligandi e l’internalizzazione, DC-SIGN modella la captazione dell’antigene, lo smistamento endosomiale e la presentazione dell’antigene, coordinando al contempo il dialogo tra immunità innata e adattativa. La segnalazione e il traffico a valle di DC-SIGN si intersecano con vie che controllano la maturazione delle cellule dendritiche, la produzione di citochine e il riconoscimento dei patogeni, influenzando la qualità del priming delle cellule T. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di DC-SIGN sono state implicate nell’elusione immunitaria da parte di microrganismi glicosilati e in contesti infiammatori in cui gli stati di attivazione delle cellule dendritiche contribuiscono a una disregolazione immunitaria associata alla malattia.

DC-SIGN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD209 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DC-SIGN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD209 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD209, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DC-SIGN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD209 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DC-SIGN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DC-SIGN nelle cellule tumorali con espressione di CD209 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.