DAGLα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402826-ACT

DAGLA codifica la diacilglicerolo lipasi alfa (DAGLα), un’idrolasi serinica associata alla membrana che converte lo sn-1-acil-2-arachidonoil glicerolo in 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), uno dei principali mediatori lipidici endocannabinoidi. Controllando la produzione di 2-AG nelle sinapsi e in altri microdomini di segnalazione, DAGLα regola la segnalazione cannabinoide retrograda attraverso i recettori CB1/CB2 e si integra con le vie guidate dai fosfoinositidi e dal diacilglicerolo. Questo enzima influenza l’eccitabilità neuronale, la plasticità sinaptica e la segnalazione neuroinfiammatoria, e un’alterata modulazione del tono endocannabinoide è stata collegata a molteplici contesti di patologie neurologiche e neuropsichiatriche. L’attività di DAGLα interseca inoltre le reti lipidiche derivate dall’acido arachidonico, rendendo DAGLA un nodo utile per studiare l’omeostasi della segnalazione lipidica e la trasduzione del segnale accoppiata agli stimoli.

DAGLα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DAGLA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DAGLα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DAGLA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DAGLA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DAGLα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DAGLA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DAGLα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DAGLα nelle cellule tumorali con espressione di DAGLA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.