Cytokeratin 5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400671-ACT

KRT5 codifica la citocheratina 5, una proteina a filamenti intermedi di tipo II che si appaia con la cheratina 14 per formare la rete di cheratine basali negli epiteli stratificati. La citocheratina 5 contribuisce alla stabilità meccanica, all’architettura dell’adesione cellula–cellula e alle risposte allo stress dell’epitelio, ed è regolata dinamicamente durante la differenziazione dei cheratinociti, la riparazione delle ferite e il mantenimento del destino delle cellule basali. Alterazioni dell’espressione di KRT5 o dell’organizzazione dei filamenti di cheratina sono associate a fenotipi di fragilità epiteliale e vengono frequentemente valutate negli studi sui programmi epiteliali di tipo basale e sugli stati di lineage tumorale. In quanto hub strutturale, la citocheratina 5 interagisce funzionalmente con il rimodellamento del citoscheletro e con vie di segnalazione legate all’adesione che influenzano la proliferazione e l’integrità della barriera.

Cytokeratin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 5 nelle cellule tumorali con espressione di KRT5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.