cytochrome c1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404958-ACT

Il gene umano **CYC1** codifica il **citocromo c1**, una subunità centrale del **complesso III** della catena respiratoria mitocondriale (ubichinolo–citocromo c reduttasi), che media il trasferimento di elettroni dall’ubichinolo al citocromo c e supporta la traslocazione di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna. Attraverso il suo ruolo nella fosforilazione ossidativa, il citocromo c1 contribuisce alla produzione di ATP, al mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale e all’omeostasi redox, con effetti a valle sulla segnalazione delle specie reattive dell’ossigeno e sull’adattamento metabolico. Alterazioni della funzione del complesso III e squilibri bioenergetici mitocondriali sono spesso associati a fenotipi neuromuscolari e metabolici e sono stati osservati in contesti di metabolismo tumorale e in altri disturbi caratterizzati da disfunzione mitocondriale. L’espressione di **CYC1** e l’integrità del complesso III sono quindi ampiamente studiate come indicatori della regolazione della catena di trasporto degli elettroni, delle risposte mitocondriali allo stress e del rimodellamento bioenergetico.

cytochrome c1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cytochrome c1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cytochrome c1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cytochrome c1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cytochrome c1 nelle cellule tumorali con espressione di CYC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.