CYP2A6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403448-ACT

CYP2A6 codifica una monoossigenasi epatica del citocromo P450 che catalizza il metabolismo ossidativo di diversi xenobiotici e substrati endogeni, contribuendo al metabolismo dei farmaci di Fase I e alla biotrasformazione delle sostanze chimiche. È uno dei principali enzimi responsabili della C-ossidazione della nicotina a cotinina e partecipa a vie di attivazione metabolica/detossificazione che influenzano l’esposizione cellulare a intermedi reattivi e lo stress ossidativo. La variabilità nell’espressione o nell’attività di CYP2A6 è associata a differenze interindividuali nella clearance degli xenobiotici e nella suscettibilità alla tossicità indotta da sostanze chimiche, contribuendo a fenotipi di rischio studiati nella ricerca farmacologica e tossicologica. CYP2A6 è quindi ampiamente utilizzato in studi sulla regolazione enzimatica, sul danno al DNA mediato dal metabolismo e sulla systems biology incentrata sul fegato.

CYP2A6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYP2A6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP2A6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYP2A6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYP2A6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP2A6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYP2A6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP2A6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP2A6 nelle cellule tumorali con espressione di CYP2A6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.