CYP2A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403450-ACT

CYP2A13 codifica una monoossigenasi del citocromo P450 umano della sottofamiglia CYP2A che catalizza il metabolismo ossidativo di diversi xenobiotici e substrati endogeni. Come componente della biotrasformazione di fase I, CYP2A13 supporta reazioni redox-dipendenti che determinano l’esposizione cellulare a sostanze chimiche inalate e sistemiche, influenzando a valle i percorsi di detossificazione e di stress ossidativo. La sua espressione e attività contribuiscono alla variabilità interindividuale della capacità metabolica, rendendolo rilevante per studi sulla sensibilità ai composti chimici e sulle relazioni genotipo–fenotipo nella biologia dell’esposizione. CYP2A13 è quindi ampiamente utilizzato come modello per indagare come il metabolismo mediato dai P450 si intersechi con la biologia epiteliale, la segnalazione infiammatoria e i meccanismi di bioattivazione dei cancerogeni nei sistemi umani.

CYP2A13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYP2A13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP2A13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYP2A13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYP2A13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP2A13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYP2A13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP2A13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP2A13 nelle cellule tumorali con espressione di CYP2A13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.