cylindromatosis 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428814-ACT

Il gene murino **Cyld** codifica la **cylindromatosi 1**, un enzima deubiquitinante che rimuove preferenzialmente catene di ubiquitina legate tramite **K63** e **M1**, attenuando la propagazione del segnale a partire dai complessi prossimali al recettore. **CYLD** agisce come regolatore negativo della segnalazione **NF-κB** e **MAPK** a valle del recettore del **TNF**, dei **recettori Toll-like** e delle vie dei **recettori dell’antigene**, influenzando così programmi trascrizionali infiammatori, sopravvivenza cellulare e risposte allo stress. Contribuisce inoltre alla dinamica del citoscheletro e a processi dipendenti dai microtubuli, modulando la migrazione cellulare e l’organizzazione dei tessuti. Un’attività o un’espressione deregolata di **CYLD** è associata a segnalazione immunitaria aberrante e alla biologia tumorale, rendendolo un nodo prezioso per studiare il controllo, dipendente dall’ubiquitina, delle reti di segnalazione.

cylindromatosis 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cyld senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cylindromatosis 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cyld nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cyld, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cylindromatosis 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cyld nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cylindromatosis 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cylindromatosis 1 nelle cellule tumorali con espressione di Cyld silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.