cyclin F Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401505-ACT

Il gene umano **CCNF** codifica la **ciclina F**, una proteina contenente un dominio F-box che funge da componente di riconoscimento dei substrati del complesso ligasi E3 dell’ubiquitina **SCF(ciclina F)** e collega la progressione del ciclo cellulare alla proteostasi. La ciclina F regola il turnover dipendente dall’ubiquitina di fattori chiave che controllano l’abilitazione (licensing) della replicazione del DNA, la biologia del centrosoma e l’integrità del genoma, coordinando così gli eventi della transizione **S/G2** e sopprimendo lo stress replicativo. Attraverso queste funzioni, **CCNF** interagisce con vie che regolano le risposte al danno al DNA, la segnalazione dell’ubiquitina e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. La disregolazione dell’ubiquitinazione dei substrati mediata dalla ciclina F è stata associata ad alterazioni del mantenimento del genoma ed è stata studiata nel contesto di disturbi proliferativi e neurodegenerazione.

cyclin F Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCNF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cyclin F Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCNF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCNF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cyclin F. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCNF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cyclin F nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cyclin F nelle cellule tumorali con espressione di CCNF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.