cyclin A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400119-ACT

CCNA2 codifica la ciclina A, un regolatore centrale della progressione del ciclo cellulare che coordina l’ingresso in fase S e la replicazione del DNA tramite l’attivazione di CDK2, e in seguito contribuisce al controllo della transizione G2/M insieme a CDK1. La ciclina A integra la segnalazione dei checkpoint e le risposte allo stress replicativo per garantire l’attivazione tempestiva delle origini, la sintesi del DNA e la stabilità del genoma, intersecando i programmi trascrizionali dipendenti da E2F e le vie di risposta al danno al DNA. Un’espressione deregolata di CCNA2 è frequentemente associata a proliferazione aberrante, instabilità cromosomica e alterata fedeltà dei checkpoint, rendendola un marcatore ampiamente utilizzato e un nodo meccanicistico negli studi sul controllo oncogenico del ciclo cellulare e sullo stress associato alla replicazione.

cyclin A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCNA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cyclin A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCNA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCNA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cyclin A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCNA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cyclin A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cyclin A nelle cellule tumorali con espressione di CCNA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.