CUL-3 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-424091-LAC

Il gene Cul3 del topo codifica CUL-3, uno scaffold di tipo cullina che assembla complessi E3 ubiquitina ligasi BTB–CUL3–RBX1 per controllare la proteostasi attraverso l’ubiquitinazione selettiva e la degradazione proteasomiale di una vasta gamma di substrati. In collaborazione con proteine adattatrici BTB, CUL-3 regola la segnalazione dello stress ossidativo (incluso l’asse KEAP1–NRF2), la progressione del ciclo cellulare, l’organizzazione del citoscheletro e il traffico endosomiale, integrando il controllo dipendente dall’ubiquitina con reti di segnalazione più ampie. Una deregolazione dell’ubiquitinazione dipendente da CUL-3 è stata collegata, in sistemi modello, ad alterazioni dell’omeostasi redox e a programmi di segnalazione aberranti rilevanti per la biologia del cancro, fenotipi del neurosviluppo e vie correlate al sistema cardiovascolare.

Le particelle di attivazione lentivirale CUL-3 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Cul3 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale CUL-3 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Cul3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di CUL-3. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Cul3 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.