CUL-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424091-ACT

Il gene Cul3 del topo codifica CUL-3, un’impalcatura centrale dei complessi di ligasi E3 ubiquitina Cullin-RING, che coordinano l’ubiquitinazione dei substrati e il loro turnover dipendente dal proteasoma. Tramite proteine adattatrici con dominio BTB, CUL-3 regola il controllo qualità delle proteine, la progressione del ciclo cellulare, la dinamica del citoscheletro e la segnalazione dello stress ossidativo, includendo vie collegate alla regolazione KEAP1–NRF2 e alla trascrizione responsiva allo stress. L’ubiquitinazione dipendente da Cul3 influenza lo sviluppo e l’omeostasi tissutale modulando l’ampiezza della segnalazione e la stabilità del proteoma. Un’attività di CUL-3 deregolata è stata associata ad alterazioni della proteostasi, a squilibrio redox e a reti di segnalazione rilevanti per la trasformazione oncogena e la neurobiologia, a supporto del suo studio in modelli pertinenti alla malattia.

CUL-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cul3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CUL-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cul3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cul3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CUL-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cul3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CUL-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CUL-3 nelle cellule tumorali con espressione di Cul3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.