CstF-77 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404038-ACT

CSTF3 codifica la subunità da 77 kDa del cleavage stimulation factor (CstF-77), un componente centrale del macchinario di processamento dell’estremità 3′ del pre-mRNA che accoppia il taglio e la poliadenilazione alla terminazione della trascrizione. Coordinando il riconoscimento dei segnali di poli(A) con altri fattori della CPA, CstF-77 contribuisce a determinare la stabilità dei trascritti, l’esportazione nucleare e la produzione proteica attraverso la poliadenilazione alternativa e il controllo della lunghezza della 3′ UTR. Alterazioni nella quantità o nell’attività dei fattori CPA possono spostare la selezione globale dei siti di poli(A) e riprogrammare le reti di espressione genica che regolano proliferazione, differenziamento e risposte allo stress. Di conseguenza, CSTF3 è spesso studiato nel contesto della disregolazione del processamento dell’RNA e delle sue associazioni con stati trascrizionali oncogenici e più ampie anomalie dell’espressione genica.

CstF-77 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSTF3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CstF-77 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSTF3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSTF3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CstF-77. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSTF3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CstF-77 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CstF-77 nelle cellule tumorali con espressione di CSTF3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.