CRTAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405828-ACT

CRTAP (proteina associata alla cartilagine) è un componente residente del reticolo endoplasmatico del complesso di 3-idrossilazione della prolina, che collabora con P3H1/LEPRE1 e PPIB/ciclofilina B per modificare e fare da chaperone ai collagene fibrillari nascenti. Attraverso la regolazione della maturazione post-traduzionale del collagene, CRTAP favorisce il corretto ripiegamento della tripla elica, la secrezione e l’assemblaggio della matrice extracellulare, collegandosi così alle vie della biosintesi del collagene e della proteostasi del RE. L’alterazione o la ridotta funzione di CRTAP compromette l’omeostasi del tessuto connettivo ed è implicata in displasie scheletriche ereditarie, incluse forme recessive di osteogenesi imperfetta. Di conseguenza, CRTAP è ampiamente studiata nella biologia della matrice, nella differenziazione di osteoblasti e condrociti e nei meccanismi di stress del RE associati a una maturazione aberrante del collagene.

CRTAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRTAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CRTAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRTAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRTAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CRTAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRTAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CRTAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CRTAP nelle cellule tumorali con espressione di CRTAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.