CRM1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400348-ACT

Il gene umano XPO1 codifica l’exportina CRM1, un recettore di esportazione nucleare della famiglia delle carioferine-β che si lega a segnali di esportazione nucleare ricchi in leucina e media il trasporto, dipendente da RanGTP, di proteine e RNA dal nucleo al citoplasma. CRM1 regola il traffico nucleo-citoplasmatico di fattori chiave del ciclo cellulare e della risposta allo stress, modulando vie che includono la segnalazione di p53, la regolazione di NF-κB, la segnalazione MAPK e la biogenesi dei ribosomi. Controllando la localizzazione subcellulare di fattori di trascrizione e oncosoppressori, XPO1 influenza la proliferazione, l’integrità del genoma e la proteostasi. Un’attività di XPO1/CRM1 deregolata e programmi di esportazione nucleare alterati sono spesso associati a stati di segnalazione oncogenica e ad altre malattie caratterizzate da risposte cellulari allo stress perturbate.

CRM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XPO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CRM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XPO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XPO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CRM1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XPO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CRM1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CRM1 nelle cellule tumorali con espressione di XPO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.