Crk-L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401097-ACT

CRKL codifica Crk-L, una proteina adattatrice SH2/SH3 che collega le tirosin-chinasi recettoriali e non recettoriali attivate a complessi di segnalazione a valle che controllano adesione, migrazione, proliferazione e sopravvivenza cellulare. Crk-L partecipa a vie guidate da integrine e fattori di crescita, incluse la dinamica delle adesioni focali e la segnalazione Ras/MAPK e PI3K, mettendo in connessione proteine “docking” fosforilate con moduli effettrici. È un nodo ampiamente studiato nella segnalazione mediata dalle chinasi della famiglia ABL ed è spesso analizzato in contesti di reti di fosforilazione su tirosina alterate. La disregolazione dell’espressione di CRKL o della sua connettività di segnalazione è associata a motilità cellulare aberrante e all’attivazione di vie oncogeniche, rendendolo rilevante per studi meccanicistici della trasformazione e di fenotipi invasivi.

Crk-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRKL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Crk-L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRKL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRKL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Crk-L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRKL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Crk-L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Crk-L nelle cellule tumorali con espressione di CRKL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.