CRBP I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402675-ACT

RBP1 codifica la proteina citosolica 1 legante il retinolo (CRBP I), un trasportatore citosolico che lega il retinolo e ne regola il traffico intracellulare, l’immagazzinamento e la conversione metabolica. Controllando la consegna del retinolo alle retinolo-deidrogenasi e al macchinario di esterificazione dei retinil esteri, CRBP I influenza l’omeostasi dei retinoidi e i programmi trascrizionali a valle dipendenti dall’acido retinoico, che modellano la differenziazione epiteliale, lo sviluppo e la regolazione metabolica. Un’espressione alterata di RBP1 è stata associata a una segnalazione dei retinoidi compromessa in contesti quali trasformazione epiteliale, fibrosi e disregolazione metabolica, rendendolo un nodo utile per studiare la biologia della vitamina A e il controllo trascrizionale. Nelle cellule umane, CRBP I offre uno strumento accessibile per indagare come la disponibilità di retinoidi si colleghi alle vie dei recettori nucleari e alle transizioni dello stato cellulare.

CRBP I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CRBP I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CRBP I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CRBP I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CRBP I nelle cellule tumorali con espressione di RBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.