CPI-17 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401966-ACT

Il gene umano PPP1R14A codifica CPI-17, un inibitore della fosfatasi della catena leggera della miosina (MLCP) dipendente dalla fosforilazione, che amplifica la contrazione della muscolatura liscia mantenendo la fosforilazione della catena leggera regolatoria della miosina. In seguito all’attivazione da parte di chinasi come PKC e ROCK, CPI-17 collega la segnalazione mediata dai recettori accoppiati a proteine G (GPCR) alla sensibilizzazione al Ca²⁺, integrando vie che controllano la dinamica del citoscheletro, la contrattilità cellulare e la motilità. Questo nodo regolatorio è ampiamente rilevante per la fisiologia della muscolatura liscia vascolare e delle vie aeree, nonché per i meccanismi di rimodellamento actomiosinico nelle cellule non muscolari. La disregolazione della segnalazione PPP1R14A/CPI-17 è stata studiata in contesti che coinvolgono tono contrattile e rimodellamento anomali, inclusi ambiti della biologia delle malattie cardiovascolari e polmonari.

CPI-17 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R14A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CPI-17 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R14A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R14A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CPI-17. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R14A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CPI-17 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CPI-17 nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R14A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.