COX5a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405025-ACT

COX5A codifica la subunità 5A della citocromo c ossidasi (COX5a), un componente del Complesso IV mitocondriale codificato dal nucleo che supporta il trasferimento di elettroni all’ossigeno e un’efficiente fosforilazione ossidativa. Modulando l’assemblaggio e l’attività della citocromo c ossidasi, COX5a influenza il flusso della catena respiratoria, il potenziale di membrana mitocondriale e la produzione di ATP, con effetti a valle sulla segnalazione mediata da ROS e sull’adattamento metabolico. Un’alterata funzione del Complesso IV è ampiamente rilevante per la disfunzione bioenergetica mitocondriale, implicata nella neurodegenerazione, in fenotipi cardiometabolici e nel rimodellamento metabolico delle cellule tumorali. L’espressione di COX5A e l’integrità del Complesso IV sono quindi comunemente analizzate in studi sulle risposte allo stress mitocondriale, sull’adattamento all’ipossia e su decisioni del destino cellulare dipendenti dall’energia.

COX5a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COX5A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COX5a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COX5A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COX5A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COX5a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COX5A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COX5a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COX5a nelle cellule tumorali con espressione di COX5A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.