connexin 43 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400241-ACT

GJA1 codifica la connessina 43 (Cx43), una delle principali proteine delle gap junction, che si assembla in emicanali e canali intercellulari per mediare lo scambio diretto tra cellule di ioni e piccoli metaboliti. Regolando l’accoppiamento elettrico, la segnalazione del calcio e la diffusione di secondi messaggeri, Cx43 influenza l’omeostasi tissutale, la contrazione coordinata, la riparazione delle ferite e la patterning dello sviluppo. La funzione della connessina 43 è integrata con le reti di adesione e del citoscheletro ed è modulata da traffico e turnover dipendenti dalla fosforilazione. Un’espressione alterata di GJA1 o variazioni del gating dei canali di connessina 43 sono associate a una comunicazione intercellulare compromessa in disturbi della conduzione cardiaca, neuroinfiammazione e invasività delle cellule tumorali, rendendola un bersaglio comune negli studi di segnalazione cellulare e dei meccanismi di malattia.

connexin 43 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GJA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

connexin 43 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GJA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GJA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di connexin 43. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GJA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da connexin 43 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via connexin 43 nelle cellule tumorali con espressione di GJA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.