connexin 26 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402132-ACT

GJB2 codifica la connessina 26, una proteina di giunzione gap a quattro domini transmembrana che si assembla in emicanali esamerici e canali intercellulari, mediando il trasferimento diretto cellula‑cellula di ioni e piccoli metaboliti. La connessina 26 sostiene l’omeostasi dei tessuti epiteliali e sensoriali coordinando l’accoppiamento elettrico, la segnalazione del calcio e la sincronizzazione metabolica, con ulteriori ruoli nel rilascio di ATP e nella comunicazione paracrina tramite emicanali in specifici contesti fisiologici. Questa proteina è centrale nelle reti di comunicazione delle giunzioni gap che influenzano differenziamento, funzione di barriera e risposte allo stress. Le varianti genetiche di GJB2 sono fortemente associate alla perdita dell’udito ereditaria e sono anche collegate a disturbi sindromici che interessano cute e tessuti annessiali, rendendolo un gene ampiamente studiato nella biologia dell’udito e nella fisiologia epiteliale.

connexin 26 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GJB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

connexin 26 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GJB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GJB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di connexin 26. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GJB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da connexin 26 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via connexin 26 nelle cellule tumorali con espressione di GJB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.