COL8A2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403831-ACT

COL8A2 codifica la catena alfa 2 del collagene di tipo VIII, un collagene a catena corta non fibrillare che contribuisce all’organizzazione della matrice extracellulare e delle strutture associate alla membrana basale. Nei tessuti oculari è arricchito nell’endotelio corneale e nella membrana di Descemet, dove sostiene l’assemblaggio della matrice, l’adesione cellulare e l’integrità biomeccanica. Il rimodellamento della matrice associato a COL8A2 si interfaccia con vie che regolano la segnalazione cellula–matrice, inclusa l’adesione mediata da integrine e il turnover della matrice extracellulare. La variabilità genetica o l’espressione deregolata di COL8A2 è stata collegata a distrofie endoteliali corneali, rendendolo un bersaglio rilevante per studiare l’omeostasi della matrice extracellulare e la funzione delle cellule endoteliali.

COL8A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COL8A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL8A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COL8A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COL8A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL8A2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COL8A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL8A2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL8A2 nelle cellule tumorali con espressione di COL8A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.