COL4A4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404186-ACT

COL4A4 codifica la catena alfa 4 del collagene di tipo IV, un componente strutturale fondamentale delle membrane basali che si assembla in reti eterotrimeriche di collagene IV, a sostegno delle interfacce epiteliali ed endoteliali. Queste reti regolano l’organizzazione della matrice extracellulare, l’adesione cellulare, la polarità e la funzione di barriera dei tessuti, influenzando processi di segnalazione quali le vie mediate dalle integrine e la meccano-trasduzione dipendente dalla matrice. Nella membrana basale glomerulare del rene, COL4A4 contribuisce all’architettura della filtrazione e alla stabilità della matrice, e un’alterazione della sua funzione è associata a nefropatie ereditarie, incluse le patologie dello spettro di Alport e i fenotipi di membrana basale sottile. La disregolazione della composizione del collagene di tipo IV influisce inoltre sui microambienti vascolari ed epiteliali, con rilevanza per la ricerca su fibrosi e rimodellamento tissutale.

COL4A4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COL4A4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

COL4A4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COL4A4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COL4A4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di COL4A4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COL4A4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da COL4A4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via COL4A4 nelle cellule tumorali con espressione di COL4A4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.