CNP-53 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403527-ACT

NPPC codifica il peptide natriuretico di tipo C (CNP-53), un ormone peptidico secreto che segnala principalmente attraverso il recettore 2 dei peptidi natriuretici (NPR2/GC-B), aumentando i livelli intracellulari di cGMP e attivando vie dipendenti da PKG. Nei tessuti umani, CNP-53 regola l’ossificazione endocondrale, la proliferazione e la differenziazione dei condrociti e l’omeostasi vascolare, integrandosi con la segnalazione mediata da cGMP per modulare il rimodellamento della matrice extracellulare e i programmi cellulari di crescita. La segnalazione NPPC–NPR2 interseca processi regolati da MAPK e dal calcio che determinano lo sviluppo della cartilagine e la crescita scheletrica. Alterazioni genetiche di NPPC o dell’asse recettoriale associato sono correlate a una crescita longitudinale ossea disordinata e a displasie scheletriche, rendendo questa via rilevante per modellare la biologia della placca di accrescimento e fenotipi del tessuto connettivo.

CNP-53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NPPC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CNP-53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NPPC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NPPC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CNP-53. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NPPC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CNP-53 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CNP-53 nelle cellule tumorali con espressione di NPPC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.