CLC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405071-ACT

Il gene umano **CLCN1** codifica per il canale del cloruro del muscolo scheletrico **CLC-1**, una conduttanza voltaggio-dipendente che stabilizza il potenziale di membrana a riposo del sarcolemma e limita le post-scariche del potenziale d’azione durante la scarica ripetitiva. Fornendo una permeabilità dominante al cloruro nelle fibre muscolari mature e contribuendo all’omeostasi ionica all’interno del sistema dei tubuli trasversi, CLC-1 aiuta a regolare l’eccitabilità di membrana e la dinamica dell’accoppiamento eccitazione–contrazione. L’alterazione della funzione di **CLCN1** è associata a una conduttanza al cloruro modificata e a fenotipi di ipereccitabilità caratteristici della miotonia congenita, rendendolo un bersaglio chiave per lo studio dei meccanismi dell’eccitabilità neuromuscolare. **CLCN1** è pertanto ampiamente utilizzato nella ricerca sull’elettrofisiologia muscolare, sul trasporto ionico e sulle relazioni genotipo–fenotipo nelle canalopatie.

CLC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLCN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CLC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLCN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLCN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CLC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLCN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CLC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CLC-1 nelle cellule tumorali con espressione di CLCN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.