claudin-9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403166-ACT

CLDN9 codifica la claudina-9, una proteina delle tight junction (giunzioni serrate) a quattro passaggi transmembrana che contribuisce a stabilire l’integrità della barriera epiteliale e la permeabilità paracellulare selettiva. Come parte dei filamenti giunzionali basati sulle claudine, la claudina-9 coordina l’adesione cellula–cellula e la polarità apico-basale e interagisce con impalcature (scaffold) giunzionali che collegano le tight junction al rimodellamento dell’actina e ai programmi di differenziamento epiteliale. Pattern alterati di espressione delle claudine sono spesso associati a una funzione di barriera compromessa, a cambiamenti nell’organizzazione tissutale e a fenotipi di transizione epitelio-mesenchimale che influenzano comportamenti legati a invasione e metastasi. CLDN9 è quindi rilevante per lo studio dell’assemblaggio delle tight junction, della morfogenesi epiteliale e della disregolazione della barriera associata a malattia in modelli cellulari umani.

claudin-9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLDN9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

claudin-9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLDN9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLDN9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di claudin-9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLDN9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da claudin-9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via claudin-9 nelle cellule tumorali con espressione di CLDN9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.