claudin-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401284-ACT

CLDN4 codifica la claudina-4, una proteina delle tight junction a quattro domini transmembrana che contribuisce a stabilire la funzione di barriera epiteliale e la polarità apico-basale regolando la permeabilità paracellulare a ioni e soluti. La claudina-4 partecipa all’assemblaggio e al rimodellamento delle tight junction attraverso interazioni con proteine di impalcatura come i membri della famiglia ZO, collegando i complessi giunzionali al citoscheletro di actina e a reti di segnalazione che influenzano differenziamento e organizzazione tissutale. Un’espressione alterata di CLDN4 è frequentemente osservata nei tumori epiteliali ed è associata a cambiamenti nell’adesione, a programmi legati alla transizione epitelio-mesenchimale e a un comportamento invasivo. Inoltre, una composizione deregolata delle tight junction che coinvolge la claudina-4 è stata implicata in contesti infiammatori e infettivi in cui l’integrità della barriera risulta compromessa.

claudin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLDN4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

claudin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLDN4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLDN4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di claudin-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLDN4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da claudin-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via claudin-4 nelle cellule tumorali con espressione di CLDN4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.