Clathrin Heavy Chain/CLTC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400863-ACT

CLTC codifica la catena pesante della clatrina, un componente strutturale fondamentale delle fossette e delle vescicole rivestite di clatrina, che coordina la curvatura della membrana e la selezione del carico durante l’endocitosi mediata da clatrina. Attraverso interazioni con complessi di proteine adattatrici e fattori accessori, CLTC regola l’internalizzazione dei recettori, il riciclo delle vescicole sinaptiche, il traffico endosomiale e il trasporto nella rete trans-Golgi, influenzando la segnalazione a valle e l’assorbimento di nutrienti. Questa via contribuisce all’omeostasi delle tirosin-chinasi recettoriali, dei GPCR e dei recettori immunitari, collegando l’attività di CLTC a reti di segnalazione proliferative e di risposta allo stress. Alterazioni genetiche e una deregolazione del traffico dipendente dalla clatrina sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e a riarrangiamenti legati a neoplasie che coinvolgono CLTC, a supporto di studi meccanicistici sui difetti di trasporto vescicolare in modelli di malattia.

Clathrin Heavy Chain/CLTC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLTC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Clathrin Heavy Chain/CLTC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLTC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLTC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Clathrin Heavy Chain/CLTC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLTC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Clathrin Heavy Chain/CLTC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Clathrin Heavy Chain/CLTC nelle cellule tumorali con espressione di CLTC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.