CLASP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404219-ACT

CLASP1 (cytoplasmic linker associated protein 1) è una proteina che segue l’estremità “plus” dei microtubuli e ne stabilizza e organizza le reti a livello della corteccia cellulare e dei cinetocori, coordinando l’assemblaggio del fuso, l’allineamento dei cromosomi e la loro corretta segregazione durante la mitosi. Attraverso interazioni con le proteine EB, le proteine CLIP e fattori associati ai cinetocori, CLASP1 sostiene il “rescue” dei microtubuli e l’instabilità dinamica, processi essenziali per la polarità cellulare, il traffico intracellulare e la migrazione direzionale. L’alterazione della dinamica dei microtubuli regolata da CLASP1 può favorire errori mitotici e aneuploidia, collegandone la funzione a vie ampiamente rilevanti per il controllo della proliferazione e la stabilità del genoma. Di conseguenza, CLASP1 è spesso oggetto di studio nelle ricerche sulla regolazione del citoscheletro, la progressione del ciclo cellulare e i meccanismi che collegano il comportamento dei microtubuli alla trasformazione cellulare e alle risposte allo stress.

CLASP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLASP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CLASP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLASP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLASP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CLASP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLASP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CLASP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CLASP1 nelle cellule tumorali con espressione di CLASP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.