citrin Double Nickaseプラスミド (m): sc-424510-NIC

マウスのSlc25a13は、ミトコンドリア内膜に存在するアスパラギン酸–グルタミン酸キャリアであるシトリンをコードしており、リンゴ酸–アスパラギン酸シャトルを支えるとともに、細胞質とミトコンドリアのレドックスバランスを中間代謝と結び付けている。シトリンは内膜を介してアスパラギン酸とグルタミン酸を交換することで、アスパラギン酸の供給を通じてアミノ酸代謝、尿素回路に連動した窒素処理、ならびに糖新生フラックスの協調に寄与する。SLC25A13機能の変化はモデル系において代謝制御異常の表現型と関連しており、Slc25a13はミトコンドリア輸送、肝細胞のエネルギー代謝、全身の栄養恒常性を研究するうえで有用な結節点となる。マウスでは、シトリン依存性輸送を撹乱することにより、ミトコンドリアキャリア活性をレドックス状態および窒素代謝に結び付ける経路を解析するための扱いやすいアプローチが得られる。

citrin ダブルニカースプラスミド（m）は、mouse 細胞株における Slc25a13 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、Slc25a13内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、Slc25a13の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、Slc25a13が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。