CIB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405501-ACT

La proteina umana CIB1 (calcium and integrin-binding protein 1) codifica CIB, un regolatore miristoilato legante il calcio di tipo EF-hand che collega i segnali di Ca²⁺ all’adesione dipendente dalle integrine e al rimodellamento del citoscheletro. CIB1 partecipa a reti di segnalazione che influenzano la dinamica delle adesioni focali, le risposte di piastrine e cellule endoteliali e vie di adattamento allo stress legate alla sopravvivenza e alla migrazione cellulare. Attraverso interazioni con le code citoplasmatiche delle integrine e con altre proteine di segnalazione, CIB1 può modulare l’attività di chinasi e programmi trascrizionali a valle che influenzano proliferazione e motilità. Un’espressione o una segnalazione di CIB1 deregolate sono state riportate in contesti rilevanti per la biologia vascolare, per meccanismi correlati alla trombosi e per l’invasione e metastatizzazione associate al cancro, supportandone l’impiego come bersaglio meccanicistico negli studi di via di segnalazione.

CIB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CIB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CIB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CIB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CIB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CIB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CIB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CIB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CIB nelle cellule tumorali con espressione di CIB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.