Chk2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400438-ACT

CHEK2 codifica la chinasi umana del checkpoint Chk2, una chinasi serina/treonina attivata a valle di ATM in risposta a rotture a doppio filamento del DNA. Chk2 propaga il segnale di danno al DNA fosforilando effettori che regolano i checkpoint del ciclo cellulare, la riparazione del DNA, l’apoptosi e le risposte allo stress replicativo, integrandosi con p53 e con altre reti di sorveglianza del genoma. Attraverso queste vie, CHEK2 contribuisce a preservare la stabilità genomica e influenza l’esito cellulare dopo stress genotossico. Un’alterazione della segnalazione CHEK2/Chk2 è associata a un controllo difettoso dei checkpoint e a una maggiore suscettibilità all’instabilità genomica osservata in molteplici contesti patologici, a supporto della sua ampia rilevanza negli studi meccanicistici.

Chk2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHEK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Chk2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHEK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHEK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Chk2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHEK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Chk2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Chk2 nelle cellule tumorali con espressione di CHEK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.