cGAS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437363-ACT

Il gene murino Mb21d1 codifica cGAS, un sensore citosolico del DNA che catalizza la sintesi di 2′3′-cGAMP quando lega DNA a doppia elica e avvia la segnalazione dell’immunità innata attraverso l’asse STING–TBK1–IRF3. Questa via induce programmi genici dell’interferone di tipo I e proinfiammatori e si integra con la restrizione antivirale, la produzione di citochine e le risposte di morte cellulare immunogenica. L’attività di cGAS è strettamente associata all’instabilità genomica e alla fuoriuscita di DNA mitocondriale, collegando le risposte al danno del DNA alla segnalazione infiammatoria. Una segnalazione cGAS–STING deregolata è stata implicata nell’autoinfiammazione e contribuisce a fenotipi infiammatori in modelli di cancro, neuroinfiammazione e stress metabolico, rendendo Mb21d1 un nodo chiave per studi meccanicistici.

cGAS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mb21d1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cGAS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mb21d1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mb21d1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cGAS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mb21d1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cGAS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cGAS nelle cellule tumorali con espressione di Mb21d1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.