CENP-F Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402178-ACT

CENPF codifica CENP-F, una grande proteina a coiled-coil associata al cinetocore che si accumula durante le fasi S/G2 e raggiunge il picco in mitosi, coordinando l’allineamento dei cromosomi, la segnalazione del checkpoint del fuso mitotico e una corretta segregazione. CENP-F partecipa all’aggancio cinetocore–microtubuli, alla funzione del centrosoma e alla progressione attraverso la transizione G2/M, collegando il controllo del ciclo cellulare all’architettura nucleare. La disregolazione dell’espressione di CENPF è stata associata a instabilità cromosomica e fenotipi proliferativi riportati in molteplici tipi di tumore, in linea con il suo ruolo nella fedeltà della mitosi. In quanto effettore strutturale regolato dal ciclo cellulare, CENP-F è spesso studiata nei pathway che governano la mitosi, il mantenimento del genoma e l’aneuploidia.

CENP-F Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CENPF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CENP-F Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CENPF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CENPF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CENP-F. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CENPF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CENP-F nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CENP-F nelle cellule tumorali con espressione di CENPF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.