Cdc50A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403231-ACT

TMEM30A codifica la subunità umana Cdc50A dei complessi flippasi fosfolipidiche P4-ATPasi, che mantengono l’asimmetria dei fosfolipidi della membrana plasmatica traslocando aminofosfolipidi tra i due foglietti del doppio strato. Sostenendo il traffico vescicolare, l’endocitosi e il riciclo delle proteine di membrana, Cdc50A influenza la polarità cellulare, la segnalazione apoptotica legata all’esposizione della fosfatidilserina e i microdomini di segnalazione dipendenti dai lipidi. L’alterazione dell’omeostasi lipidica dipendente da TMEM30A/Cdc50A è stata associata a un turnover recettoriale modificato, a risposte infiammatorie e a fenotipi di stress cellulare rilevanti per la neurobiologia, l’immunità e il rimodellamento della membrana associato al cancro. Queste funzioni rendono Cdc50A un utile punto di partenza per studiare l’asimmetria di membrana, le vie di traffico e le reti di segnalazione regolate dai lipidi nelle cellule umane.

Cdc50A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM30A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdc50A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM30A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM30A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdc50A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM30A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdc50A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdc50A nelle cellule tumorali con espressione di TMEM30A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.