Cdc34 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403783-ACT

CDC34 codifica l’enzima umano E2 coniugante l’ubiquitina Cdc34, un componente centrale dei complessi E3 ubiquitina-ligasi SCF (SKP1–CUL1–F-box), che catalizzano la poliubiquitinazione di proteine regolatorie destinate alla degradazione da parte del proteasoma. L’attività di Cdc34 è strettamente legata alla progressione del ciclo cellulare, in particolare al controllo della transizione G1/S, poiché promuove il turnover di substrati chiave che regolano la replicazione del DNA e la segnalazione dei checkpoint. Attraverso il suo ruolo nella proteostasi dipendente dall’ubiquitina, CDC34 è connesso a vie che governano proliferazione, stabilità del genoma e risposte allo stress. L’alterata espressione di CDC34 o la deregolazione dell’asse SCF sono frequentemente studiate nel contesto della segnalazione oncogenica e di altre patologie caratterizzate da programmi aberranti di degradazione proteica.

Cdc34 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDC34 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdc34 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDC34 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDC34, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdc34. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDC34 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdc34 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdc34 nelle cellule tumorali con espressione di CDC34 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.