Cdc16 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404163-ACT

CDC16 codifica Cdc16, una subunità centrale del complesso promotore dell’anafase/ciclosoma (APC/C), che agisce come ligasi E3 dell’ubiquitina e controlla la proteolisi ordinata durante la mitosi e la fase G1. Sostenendo l’assemblaggio dell’APC/C e il riconoscimento dei substrati, Cdc16 contribuisce alla degradazione tempestiva delle cicline e di altri regolatori del ciclo cellulare, garantendo così la fedeltà del checkpoint del fuso mitotico e una corretta segregazione dei cromosomi. Un’alterazione della regolazione dell’APC/C è associata a stress replicativo, aneuploidia e modifiche della capacità proliferativa, rendendo CDC16 rilevante per gli studi sulla stabilità del genoma e sulla disregolazione del ciclo cellulare associata al cancro. CDC16 viene inoltre utilizzato come nodo per analizzare il controllo, mediato dalla via ubiquitina–proteasoma, dell’uscita dalla mitosi e dell’adattamento del checkpoint.

Cdc16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDC16 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdc16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDC16 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDC16, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdc16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDC16 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdc16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdc16 nelle cellule tumorali con espressione di CDC16 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.